- 罗伯特·C·艾伦（Robert C Allen）教授研究了中性粒细胞呼吸爆发的新陈代谢如何将氧气转化为杀死微生物的物质。与中性粒细胞杀菌作用相关的光辐射证明了这种作用的燃烧性质。
- 在过去的 40 年中，Allen 发明了灵敏的发光酚和荧光素发光技术，用于量化和区分吞噬白细胞和巨噬细胞的氧化酶和卤过氧化物酶的活性。
- 发光测量的判别分析适用于衡量先天性免疫的状态。血液中性粒细胞的反应状态反映了体内的免疫激活和炎症状态。
氧气对地球上包括人类在内的许多生物的生存至关重要。然而，在我们体内，氧气也是抵御微生物入侵的有力武器。在血液中，被称为红血球的红细胞将新陈代谢所需的氧分子带到全身各处，而被称为中性粒细胞的白细胞则对微生物感染做出反应，迁移到感染部位，接触并吞噬微生物，并将氧气转化为负责燃烧杀灭微生物氧合的反应物。中性粒细胞的充氧活动速度快，重点是杀死微生物病原体。
燃烧和化学发光
罗伯特·C·艾伦（Robert C Allen）通过一系列精妙的研究表明，了解 我们免疫系统复杂的生化机制中氧气的作用与氧分子独特的电子结构息息相关。中性粒细胞通过更改前沿轨道电子的分布来改变氧分子的自旋多重性状态。在中性粒细胞中，来自大气的化学惰性三重多重性氧分子（3O2）被转化为可逸散的电子激发单重多重性氧分子（1O2*），后者很容易与微生物的单重多重性生物大分子发生反应，从而产生杀死微生物的燃烧性氧合反应。艾伦的核心前提是，1O2*与微生物的单复数分子发生的反应是允许自旋的，而且是高度放能的。这种氧合反应可产生电子激发的单复数羰基产物，这些产物通过光发射（即化学发光）弛豫到基态。
化学发光探针可以灵敏地测量吞噬细胞呼吸爆发的燃烧作用
在传统的燃烧化学过程中，能量作用于单重燃料分子（1分子），导致同解键裂解，产生两个自由基双重分子（2分子）产物。产生的双态自由基可与基态三氧（3O2）发生双三重反应，产生双态产物，并在自由基传播过程中与额外的3O2发生反应。
中性粒细胞不是使微生物底物分子自由基化，以促进反应性双三重反应的传播，而是使顺磁性3O2去自由基化，生成二磁性1O2*，从而使其能够参与与微生物单分子的单重-单重反应。无论是燃烧还是中性粒细胞二氧化，任何类型的燃烧都必须保持自旋。燃烧的放热性足以产生光发射。
追踪氧气在吞噬细胞杀菌作用中的作用路径
化学发光可对吞噬细胞的杀微生物氧合反应进行无损测量。使用化学发光探针（即容易发生二氧化反应产生电子激发单羰基的有机分子），可大大提高吞噬细胞氧化还原代谢和卤过氧化物酶活性的发光测量灵敏度和特异性。 函数和光子发射。在这方面，荧光素发光需要还原性二氧反应，可对吞噬细胞的 NADPH 氧化酶活性进行高灵敏度和特异性测量。鲁米诺发光需要简单的二氧反应。通过鲁米诺可以对中性粒细胞卤过氧化物酶的作用进行高灵敏度的发光测量，但它并不具有卤过氧化物酶的特异性。通过鲁米诺可以测量缺乏卤过氧化物酶的巨噬细胞和缺乏卤过氧化物酶的异嗜性白细胞中的氧化酶活性（Merrill 等人，1996 年）。1986 年，Allen 在《酶学方法》（Methods in Enzymology）杂志上发表了一篇颇具影响力的论文，证明了通过使用化学发光探针荧光素（lucigenin）和发光酚（luminol），可分别对吞噬细胞氧化酶和髓过氧化物酶的活性进行高灵敏度和差异定量分析。
微重力适应
艾伦的方法提供了有关免疫系统动态的信息，可用于研究人体在各种条件和环境下如何对病原体做出反应。有趣的是，这些现象并不局限于地球上的生命。最近在国际空间站（ISS）上开展的工作中，艾伦的方法被用于监测哺乳动物巨噬细胞在呼吸爆发条件下发生的反应，巨噬细胞是一种组织吞噬细胞，通过吞噬和消化微生物、癌细胞和外来物质等病原体，在免疫系统中发挥着重要作用。这项研究表明，巨噬细胞在经过呼吸爆发反应的初始抑制阶段后，很快就能适应微重力环境，一般只需几秒钟。这是一个重要的发现，揭示了一个长期存在的问题，即尽管哺乳动物细胞在微重力条件下承受着严重的压力，但为什么许多宇航员在太空中长期逗留而对健康没有明显的不良影响。
人工智能和测量细胞发光的能力有助于开发用于监测免疫系统的新型诊断工具
将分类统计分析应用于免疫系统
人体免疫系统是一个错综复杂的网络，其特点是基因、蛋白质、细胞和组织之间的动态相互作用。这是一个庞大而复杂的结构，比人类基因组大数十亿倍。人与人之间的个体差异以及年龄、遗传和环境条件等因素的持续调节影响，进一步加剧了这种复杂性。这一错综复杂的系统是重要健康干预措施的基础，包括疫苗和最先进的免疫疗法。
先进的计算能力与判别分析的分类统计方法相结合，促进了对免疫系统功能的研究。通过化学发光探针可以测量和区分静息和受刺激的中性粒细胞氧化酶和卤过氧化物酶的功能，并能估算最大启动中性粒细胞溶蛋白受体（MOR）表达的循环比率（COR）。COR:MOR 比值衡量体内的炎症状态。公制采集只需要亚微升量的血液或组织液。对获取的时间数据进行判别分析，可提供适用于研究和传染病临床管理的信息。这种时间分析也与骨髓造血的监测有关。
护理诊断工具新颖点
Allen 及其合作者利用判别分析证明了复合化学铝原探针的实用性。最近的工作方向是简化程序和技术，尽量减少血液标本的采集、快速稀释和使用 96 孔微孔板直接进行发光测量。血液或液体经过缓冲介质的千倍稀释，重新形成二价阳离子并消除抗凝剂的影响。在使用或不使用免疫引物、化学或吞噬刺激物的情况下，小于一微升的样本直接与适当的化学发光探针接触。用自动 Berthold 微孔板发光仪测量光发射，并收集综合数据并用于判别分析。测试功能强大，结果可重复，并可使用手持式或便携式发光仪进行床旁检测。
化学发光探针的基本原理是什么？是哪些步骤促使您扩展这种方法，创造出一种实时监测免疫系统反应的工具？
吞噬中性粒细胞发出的光（即原生发光）是燃烧性杀微生物二氧活动的能量产物，利用闪烁计数器在非入射模式下的光子计数功能很容易进行测量。然而，吞噬巨噬细胞的原生发光活性并没有足够高于仪器背景噪声。我的推理是，添加一种易与吞噬巨噬细胞产生的含氧物质发生反应的高发光量子产率分子，可以增加光产率，从而实现发光检测。鲁米诺（Luminol）是第一个接受测试的化学发光探针，它大大提高了发光率，从而可以灵敏地检测活化巨噬细胞的氧合活动。在研究吞噬中性粒细胞时，相对于自然光发射，发光酚使光发射增加了几个数量级（Allen 和 Loose，1976 年）。
化学发光探针的定义是一种分子底物，容易发生二氧化反应，产生内过氧化物或二氧杂环丁烷中间体，最终产生电子激发的羰基，通过光子发射进行弛豫。选择具有不同反应电位的化学发光探针，可以对二氧化活动进行不同的测量。褐藻素发光需要还原性二氧反应，即结合两个电子和一个氧分子。这种还原性二氧反应的要求可以通过吞噬细胞产生一个单态过氧化氢（H2O2），或通过将翠绿素一价还原成双态自由基再与双态多价超氧阴离子（2O2-）反应来实现。请注意，所有可能的反应物都是活化的 NADPH 氧化酶的产物（Allen，1981 年）。
在碱性环境中，荧光酚可以参与复杂的自由基（双）反应，最终形成带有荧光的内过氧化物，但在弱酸性环境中，荧光酚的荧光是非自由基卤过氧化物酶催化的二氧化反应的产物（Allen, R, 2022 年）。使用荧光素和发光酚可以对吞噬血液的中性粒细胞进行灵敏的差异发光测量。测量未引诱和最大引诱吞噬中性粒细胞的发光比率，可衡量中性粒细胞应对吞噬挑战的体内能力。这种循环（COR）与最大受体（MOR）的比率反映了采血时体内的炎症状态。当体内炎症接近最大值时，COR:MOR 的比率接近统一。
分类统计分析在开发测量免疫系统功能的新医疗工具中发挥什么
作用？
通过对氧化酶和卤代过氧化物酶活性进行不同的化学发光探测，再加上对每个亚毫升血液或体液样本进行 COR:MOR 比率测定，可以生成相对较大的发光数据库。到 20 世纪 80 年代，综合测量产生的数据表明，需要进行先进的数据处理和分析。USAISR（美国陆军外科研究所）的 AD Mason 教授建议采用统计分类或聚类方法。
判别分析是一种统计分类方法，适用于将一个分类（即非度量或描述性）因变量与一个或多个度量自变量联系起来。如果涉及三个或更多分类，则采用多重判别分析（MDA）技术。两个或更多独立（发光指标）变量的线性组合有助于区分特定组别，即健康人类宿主和受感染人类宿主。从统计学角度看，目标是使组间方差相对于组内方差最大化（Allen 等人，2000 年）。MDA 已成功应用于正在接受各种传染病治疗的人类患者、接受骨髓刺激剂 rG-CSF（重组人粒细胞集落刺激因子）治疗的健康年轻和年龄较大的人类志愿者以及接受内毒素治疗的健康人类志愿者的发光分析。所有研究都分别评估了疾病的时间进程（Allen 和 Stevens，1992 年；Stevens 等人，1994 年）、rG-CSF 后的时间进程（Chatta 等人，1994 年；Allen 等人，1997 年）和内毒素输注后的时间进程（Taylor 等人，2000 年）。
怎样才能创造出一种用于免疫系统的护理点检测工具，并使其能够普遍使用？
目前，中性粒细胞的数量和功能可通过稀释和荧光测定法，使用亚微升量的血液或体液进行实时快速评估。此类测量适用于临床实验室环境或任何可使用护理定点发光检测设备的场所（Allen 等人，美国专利申请号 2022/0308046 A1）。
